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0　引言

壇紫菜( Porphy ra ha itanensis) 屬暖溫帶性海藻, 在我國東南沿海均有分布, 是優良海藻栽培品種之一. 但近年來壇紫菜種質退化、品質下降, 造成生長期縮短、病害嚴重、產量降低. 因此, 選育高產、抗病、耐高溫的紫菜新品種已成為亟待解決的問題. 藻膽蛋白和葉綠素含量是紫菜品質選育方面的重要指標之一. 藻膽蛋白是紅藻、藍藻和某些甲藻中的一類特有的光合作用天然色素, 可分為藻紅蛋白( PE) 、藻藍蛋白( PC) 、別藻藍蛋白(APC) 三大類. 藻膽蛋白具有很高的開發利用價值, 既可以作為天然色素用于食品、化妝品、染料等工業, 也可以制成熒光試劑, 用于臨床醫學診斷和免疫化學及生物醫學等領域. 葉綠素則是一類不穩定的化合物, 葉綠素含量不僅與生長速度有很大關系, 并且干紫菜中葉綠素含量的多少與感官測定紫菜優劣最為一致. 細胞的葉綠素含量隨種類和類群而有所不同, 同時還受年齡、生長率、光照和營養條件的影響. 自20世紀中葉發現藻膽蛋白以來, 國內外學者對藻膽蛋白的性質和化學組成進行了大量的研究, 而且對于海藻不同生長階段藻膽蛋白的含量以及氮源、光照對藻膽蛋白含量的影響進行了研究. 但是,不同色澤紫菜品質的比較研究以及在實驗過程中各測定條件對藻膽蛋白和葉綠素a測定結果的影響,報道甚少. 本實驗旨在了解不同色澤壇紫菜在不同培養條件下的藻膽蛋白及其葉綠素a含量的差異,以及測定過程中各因素對測定結果的影響, 從而為壇紫菜優良品種的選育提供品質方面的指標.

1　材料與方法

1.1　材料

各種不同品系的壇紫菜由集美大學水產學院壇紫菜種質改良及應用實驗室提供, 挑選藻體完整,顏色正常, 有光澤、彈性好的生長盛期藻體.

1.2　不同色澤藻體的培養

從褐紅色、紫色、紅色、桔紅色、綠色5種不同色澤的藻體幼苗中挑選長度為3～5 cm、完整健康的藻體進行充氣培養, 實驗室內溫度維持在(20 ±1) ℃, 并定期更換培養液. 待藻體生長至長度為40～80 cm時, 陰干后冷凍收藏備用.

1.3　不同溫度條件藻體的培養

本溫度實驗設定了26、27、28、29、30 ℃共5個高溫實驗組和1個對照組(21 ℃) , 實驗藻體包括品系Z - 17的F3、Z - 26的F3、Z - 61的F3、Z - 81的F3 4個不同品系. 挑選完整健康的實驗藻體(3～5 cm) 放入錐形瓶中, 在不同溫度的光照培養箱中靜置培養. 光周期為12 L∶12 D, 光強為1 200～1 400 lx. 培養期間每天觀察記錄葉狀體生長狀況和潰爛程度, 搖動培養液2次以使其混合均勻. 每組藻體培養10 d, 藻體陰干后冷凍收藏備用.

1.4　藻膽蛋白與葉綠素a含量的測定

藻膽蛋白的測定方法參照文獻, 略有改動. 從冰箱中取出冷凍的藻體, 稱2～3 g, 用適量蒸餾水快速洗滌3遍, 平鋪在干凈干燥的紗布上約1～3層, 在風扇前吹干或在空調室陰干, 放在粉碎器中, 間歇粉碎至粉末狀. 精確稱取0.010 g和0.030 g各1 份, 放在研磨管中, 加入適量的0.05 mol/L 磷酸鈉緩沖液浸泡約3 min, 研磨至充分, 倒入50 mL燒杯中, 用緩沖液沖洗研磨管3次以上, 燒杯中液體總體積約為20 mL, 蓋上鋁箔蓋子, 放入冰箱冷凍( - 20 ℃) , 然后室溫避光解凍,如此反復凍融6次, 將提取液用300目篩絹網過濾至50 mL離心管中, 濾液于4 ℃、10 000 r/min離心20 min, 取上清液, 定容至50 mL, 搖勻后分別于565、615、650 nm波長下測定其OD值.葉綠素a含量的測定方法參照文獻, 略有改動. 粉碎冰凍藻體的處理方法與測定藻膽蛋白的一致, 然后精確稱取0.010 g和0.030 g各1份, 放在研磨管中, 加入適量的90 %的丙酮水溶液浸泡約3 min, 研磨至充分(研磨過程應避免強光照射) , 倒入40 mL的棕色磨口瓶中, 用90 %的丙酮水溶液沖洗和研磨, 蓋上瓶蓋, 將棕色磨口瓶放在避光的地方室溫提取葉綠素24 h. 提取液用300目篩絹網過濾至50 mL離心管中, 濾液于4 ℃、10 000 r /min離心20 min, 取上清液, 測定其體積, 搖勻后分別于666、730 nm波長下測定其OD值.或者直接用手持葉綠素計、SPAD502葉綠素含量測定儀來進行測定。

1.5　陰干藻體烘干質量的測定

稱取陰干藻體01100 g, 放入培養皿中于105 ℃烘干3 h, 溫度稍降后即稱其質量(防止吸潮).

1.6　不同前處理條件藻膽蛋白與葉綠素a含量的測定

1) 研磨與粉碎. 在對實驗藻體進行處理時, 一組進行研磨, 另一組進行粉碎, 其他實驗條件均相同, 分別進行藻膽蛋白與葉綠素a含量的測定.

2) 黑暗與光照. 在藻膽蛋白和葉綠素a的提取過程中, 一組避光(黑暗) , 另一組在3000 lx光照條件下提取, 其他實驗條件均相同, 分別進行藻膽蛋白與葉綠素a含量的測定.

3) 被測藻體的質量. 被測藻體質量分別為0.010、0.030、0.050 g. 其他實驗條件均相同, 分別進行藻膽蛋白與葉綠素a含量的測定.

4) 凍融次數. 實驗藻體研磨后, 一組不凍融, 放在4 ℃冰箱中提取; 一組凍融3次; 一組凍融6次. 其他實驗條件均相同, 然后分別進行藻膽蛋白含量的測定.

5) 研磨溫度. 在對實驗藻體進行研磨時, 一組在室溫條件下研磨, 一組用4 ℃的冷水保持低溫條件研磨. 其他實驗條件均相同, 然后分別進行藻膽蛋白含量的測定.

1.7　數據的計算與處理

藻膽蛋白和葉綠素a含量的計算參照文獻的公式計算; 數據處理用SPSS1310的單因素方差分析(one2way anova) 和t2test進行統計分析.

2　結果

2.1　不同色澤藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量的差異

如圖1、圖2所示, 不同色澤的壇紫菜藻膽蛋白和葉綠素a的含量差異較大. 在所進行測定的5種不同色澤的壇紫菜中, 褐紅色型壇紫菜的藻膽蛋白和葉綠素a 的質量比均為最高, 分別達到114.87 mg/g和8.83 mg/g; 紫色型的藻膽蛋白的質量比高達108.05 mg/g, 但是葉綠素a的質量比卻較低(4.64 mg/g) ; 桔紅色型藻體的藻膽蛋白和葉綠素a的質量比均比較低, 分別為59.81 mg/g和4.58 mg/g; 綠色型的藻膽蛋白的質量比最低(55.39 mg/g). 統計分析表明桔紅色和綠色藻膽蛋白的質量比差異顯著( P < 0.05) , 其余色澤間差異極顯著( P < 0.01) .

2.2　不同培養溫度對藻體色素含量的影響

在不同溫度的培養實驗中, 隨著溫度升高藻體容易出現潰爛. 在28、29 ℃培養的藻體顏色明顯變淡, 生長緩慢或者不生長. 在4個不同品系的溫度實驗中, 除Z - 26的F3外, 對照組藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量均低于高溫培養條件下生長的藻體. 除Z - 17的F3的27 ℃實驗組外, 各高溫實驗組藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量隨著溫度升高而增加.

2.3　不同前處理條件對藻膽蛋白和葉綠素a含量測定結果的影響

1) 研磨與粉碎. 經過研磨藻體的藻膽蛋白和葉綠素a測定結果明顯高于經過粉碎的. 經過研磨,紫色型和桔色型藻體的總藻膽蛋白含量分別是經過粉碎的3.8倍和2.4倍. 經過研磨藻體的葉綠素a的質量比測定結果分別是經過粉碎的10.4倍和11.9倍.

2) 光照與黑暗. 采取避光措施的紫色型和桔色型藻體的藻膽蛋白的質量比分別比在3 000 lx光照條件下提取的高24.9 %和26.6 %. 而光照對葉綠素a測定結果的影響更大. 在光照條件下提取的紫色型和桔色型藻體的葉綠素a的質量比測定結果分別為0.48 mg/g和2.04 mg/g; 而在鋁箔包裹的棕色瓶中提取的藻體, 葉綠素a的質量比分別達到4.82 mg/g和5.47 mg/g, 分別是光照下提取的10.0倍和2.7倍.

3) 被測藻體的質量. 被測藻體的質量對藻膽蛋白和葉綠素a的質量比的測定結果沒有明顯的影響.

4) 凍融次數與研磨溫度. 藻膽蛋白的含量隨著凍融次數的增加而略有增加, 研磨溫度對藻膽蛋白的測定結果影響較小.

3　討論

3.1　壇紫菜色素含量與生長的關系

壇紫菜選育可以通過蛋白質、藻膽蛋白以及葉綠素a含量、生長速度、藻體厚度等重要指標來確定其品種的優劣. 藻膽蛋白是壇紫菜光合作用中重要的輔助色素蛋白, 其中藻紅蛋白在紅藻的捕光色素系統中首先捕獲光能, 然后傳遞給藻藍蛋白, 再傳遞給別藻藍蛋白; 藻膽蛋白還可以作為藻體細胞的貯存蛋白, 有利于藻類在自然界中的生存競爭. 壇紫菜在不同生長期, 藻膽蛋白總量占干壇紫菜的百分含量由初期到盛期基本不變, 到末期大幅度減少. 藻膽蛋白在藻體細胞中直接參與光合作用中的能量吸收和傳遞. 葉綠素a是壇紫菜重要的光合色素, 含量的高低與藻體本身的營養生長旺盛與否密切相關. 本實驗結果表明不同色澤的壇紫菜4種主要色素的差異顯著, 其中褐色型藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量較高, 相應地該品系的藻體生長較快; 而生長相對較慢的桔紅色型藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量較低. 這充分證明了藻膽色素和葉綠素a作為紫菜光合作用的捕光色素, 與紫菜生長的關系密切.

3.2　測定條件對壇紫菜色素含量測定結果影響的分析

藻膽蛋白屬于胞內蛋白質, 要破碎海藻細胞的細胞壁、細胞膜, 才能使藻膽蛋白以溶解的狀態釋放出來, 并注意保持其活性. 細胞破碎程度越高, 藻膽蛋白的得率和純度也越高, 不同的細胞破碎方法提取效果不同. 因此, 采用何種細胞破碎技術是直接影響藻膽蛋白提取效率的關鍵因素之一.本實驗以藻膽蛋白含量測定結果為指標, 對研磨法和反復凍融法的破壁效果進行比較, 結果顯示研磨法能破碎80 %以上的細胞, 若將研磨法和反復凍融法結合起來, 先用研磨法破碎絕大多數的細胞,針對游離的細胞再用反復凍融法使其破碎, 能更加準確地測定細胞的胞內物質含量. 藻膽蛋白在受熱或強光照射時易變性, 葉綠素受光照時容易氧化分解, 因此在提取過程中應避免光照并保持低溫.

3.3　壇紫菜主要色素的應用前景展望

壇紫菜作為一種經濟價值很高的紅藻, 具有多種生物活性成分, 如紫菜的多糖具有降血脂、免疫調節、抗凝血等功能; 紫菜的β - 胡蘿卜素能猝滅生物體內化學活性很高的自由基, 從而降低因自由基誘發的過氧化作用, 具有延緩衰老和抵抗癌癥的作用. 而且壇紫菜除了其食用、藥用、營養和提取活性物質等價值外, 不同色澤的壇紫菜在發展觀賞業、提取色素和制成色澤鮮艷的食品等方面都具有重要的開發價值. 藻膽蛋白作為紫菜體內的捕光色素蛋白和胞內儲存蛋白, 同樣也具有重要的生理功能; 而葉綠素不僅與生長速度有很大關系, 并且干紫菜中葉綠素含量的多少跟感官評定紫菜優劣最為一致. 因此, 本研究能更加準確地測定藻膽蛋白和葉綠素a含量, 為紫菜優良品種的選育和應用提供依據. 本研究還初步探討了藻膽蛋白和葉綠素a含量與培養環境的關系, 但是, 對于環境因素所引起的細胞在微觀水平上的變化及生理機理, 還有待于進一步的研究.